超低溫保存技術(shù)在果樹種質(zhì)資源保存中的應(yīng)用及國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 MVE液氮罐

摘要：超低溫保存是作物種質(zhì)資源離體保存的有效方法之一。本文概述了超低溫保存技術(shù)在果樹種質(zhì)資源保存中的應(yīng)用及國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，對(duì)存在的問(wèn)題進(jìn)行了分析，并對(duì)其發(fā)展提出了建議。

關(guān)鍵詞：果樹;種質(zhì)資源;離體保存

植物種質(zhì)超低溫保存是指在低于-196℃的低溫條件下對(duì)植物器官、組織或細(xì)胞進(jìn)行保存。在這樣的低溫條件下，植物材料的代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎完全停止，因此，能夠有效保持材料的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)又不會(huì)喪失其形態(tài)發(fā)生的潛能。所以，這是一種不需要繼代的長(zhǎng)期保存植物種質(zhì)的，也是果樹品種改良和分子遺傳學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)。

隨著現(xiàn)代果品業(yè)的發(fā)展，種質(zhì)資源的重要性越來(lái)越被重視。1968年Quatran成功地保存了亞麻細(xì)胞，拉開了植物冰凍保存的帷幕。1973年Nag和Street超低溫保存胡蘿卜懸浮細(xì)胞獲得成這是植物種質(zhì)超低溫保存的首次報(bào)道，之后超低溫保存技術(shù)在植物種質(zhì)保存方面的研究和應(yīng)用逐漸深入。

將超低溫保存技術(shù)與組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，可以將大量的果樹種質(zhì)儲(chǔ)存在液氮罐中。這種保存形式的優(yōu)點(diǎn)是果樹的種質(zhì)保存不受土地、人力等條件的限制且取材方便、效率高、極大地節(jié)省開支;此外，還可以避免種質(zhì)保存過(guò)程中的自然變異，保證種質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)有利于種質(zhì)在國(guó)際間的交換。

1、材料的選擇

由于植物的基因型、抗凍性以及器官、組織和細(xì)胞的年齡、生理狀態(tài)等因素對(duì)超低溫保存效果有較大的影響，從而要求在整個(gè)保存處理過(guò)程中采取相應(yīng)的符合其材料特性的各種措施。不同基因型的植物材料對(duì)超低溫保存的反應(yīng)各不相同，凍后存活率的顯著差異不僅存在于種間，也存 在于不同品系間。趙艷華等(1998)在包埋干燥超低溫保存蘋果離體莖尖時(shí)發(fā)現(xiàn)，材料的生理狀態(tài)對(duì)莖尖存活率的影響甚至比保存過(guò)程中處理 因素的影響更大。因此， 在進(jìn)行超低溫保存前，對(duì)材料的選擇十分重要?？梢赃M(jìn)行超低溫保存的材 料種類很多，主要分為4類：①莖尖和側(cè)生分生組織;②原生質(zhì)體;③懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織和 體細(xì)胞胚;④其他植物器官，如胚、子房、花粉、 花藥、種子等。

2、超低溫保存種質(zhì)資源的研究進(jìn)展

2.1 超低溫保存技術(shù)在蘋果和梨中的研究進(jìn)展 邵建柱(2003)[11] 對(duì)蘋果等果樹種質(zhì)資源的 離體保存進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)試管苗狀態(tài)的調(diào)整、外植體類型及大小的選擇，結(jié)合密閉減少氧氣供應(yīng)和水分蒸發(fā)，成功地建立了適合蘋果等果樹離體材料的常溫緩慢生長(zhǎng)法保存技術(shù)。確定了15個(gè)梨品種離體莖段培養(yǎng)物的通用繼代培養(yǎng)基，即MT+1.0mg/LBA+0.1mg/LNAA+2.0mg/LGA3，為梨的離體保存研究初步奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)還完善了蘋果和梨離體莖段的常低溫保存技術(shù)，使得蘋果和梨離體莖段在(3±0.5)℃條件下，保存28個(gè)月和24個(gè)月后，仍保持近100%存活率。進(jìn)一步完善了蘋果莖段的超低溫保存技術(shù)，確立了甘油和ABA在預(yù)處理中的重要作用。

以蘋果離體莖尖為試材，對(duì)蘋果離體莖尖超低溫保存方法比較發(fā)現(xiàn)，包埋干燥法操作程序簡(jiǎn)單，存活率及再生率高，為最佳的保存方法。

2.2超低溫保存技術(shù)在枇杷中的研究進(jìn)展

采用干凍化法對(duì)枇杷花粉超低溫 保存進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：花粉的含水量是決定枇杷花粉超低溫保存成敗的關(guān)鍵因素， 30%左右的含水量能夠保證超低溫保存后花粉的活力;解凍溫度及方式對(duì)超低溫保存后花粉的存活力沒有明顯影響。

對(duì)經(jīng)過(guò)干燥脫水至不同含 水量的枇杷離體花粉進(jìn)行了超低溫(-196℃)保存試驗(yàn)。結(jié)果表明：超低溫保存花粉時(shí)，花粉的含水量多寡是成敗的關(guān)鍵。對(duì)于枇杷而言，選擇含水量為13%左右的花粉比較合適?；ǚ墼谝旱?中保存2、8h和24h，其發(fā)芽率無(wú)顯著差異。

2.3 超低溫保存技術(shù)在百合中的研究進(jìn)展

對(duì)百合莖尖玻璃化超低溫保存基本條件進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)前處理和解凍方 式是影響超低溫保存存活率的主要因素。

以百合試管苗莖尖分生組織為材料，對(duì)玻璃化法超低溫保存技術(shù)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，并通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)影響超低溫保存存活率的主要影響因素(預(yù)培養(yǎng)基中蔗糖濃度、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間和PVS2處理時(shí)間)進(jìn)行了分析，初步建立了百合種質(zhì)超低溫保存的最佳技術(shù)方案。

2.4 超低溫保存技術(shù)在櫻桃中的研究進(jìn)展

櫻桃種質(zhì)資源的離體保存研究起步較晚，目前尚未見大規(guī)模離體保存庫(kù)建立的報(bào)道。Marthe對(duì)兩個(gè)櫻桃的中間砧進(jìn)行過(guò)液氮超低溫保存研究。Niino采用PVS2玻璃化液對(duì)5個(gè)甜櫻桃品種和2個(gè)櫻桃砧木進(jìn)行超低溫保存，試驗(yàn)中所使用的玻璃化液中DMSO對(duì)材料具有毒害作用，高含量的蔗糖又會(huì)加劇材料的褐化，導(dǎo)致保存后 莖尖再生困難。趙艷華等(1999)對(duì)馬哈利櫻桃的超低溫保存研究發(fā)現(xiàn)PVS3的效果最好。 牛愛國(guó)在MS培養(yǎng)基中添加10g/L甘露醇可使試管苗保存7.5個(gè)月，母株存活率62%，繼代后成 活率83%。

2.5 超低溫保存技術(shù)在其它植物中的研究進(jìn)展

以離體培養(yǎng)的栗子莖尖為 材料，對(duì)超低溫保存過(guò)程中的影響因素進(jìn)行研究， 所有基因型的材料均獲得再生植株，有的高達(dá)38%～54%，建立了有效的超低溫保存程序。

對(duì)木瓜的超低溫保存技術(shù)進(jìn)行了研究，建立了高效率的超低溫保存的玻璃化程序：即在含有0.09mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)45～50d，然后轉(zhuǎn)移至2.0mol/L丙 三醇+0.4mol/L蔗糖的培養(yǎng)基中， 25℃下包埋處理60min;然后轉(zhuǎn)移至PVS2中， 0℃脫水處理80min，然后迅速投入液氮中，經(jīng)過(guò)解凍處理獲得90%的再生率，是一種高效的超低溫保存木瓜方法。

采用玻璃化法對(duì)草莓莖尖的離體超低溫保存進(jìn)行了初步研究。研究表明，預(yù)培養(yǎng)12d的莖尖存活率最高，為82.4%;其次 為6d， 為77.8%;不經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的最差，為15.8%。不同品種的成活率和成苗率有差異，寶交早生的 成活率高于UC5，而寶交早生成活莖尖的成苗率(79%)低于UC5(100%)。

首次采用玻璃化法對(duì)荔枝 胚性懸浮細(xì)胞進(jìn)行超低溫保存。適宜的保存程序?yàn)椋喝Q液后3～5d的胚性懸浮細(xì)胞→0.4mol/L的山梨醇液中預(yù)培養(yǎng)2d→室溫下60%PVS2預(yù)處理15min→0℃下PVS2處理15～20min→迅速投入液氮→40℃水浴快速化凍→1.2mol/L蔗糖+MS基本培養(yǎng)基洗滌→TTC檢測(cè)和恢復(fù)生長(zhǎng)。TTC檢測(cè)保存細(xì)胞的相對(duì)存活率高達(dá)27.1%。

3、超低溫保存中存在問(wèn)題

3.1 冰凍保護(hù)劑

目前使用的冰凍保護(hù)劑種類很多，按其是否 能滲透到細(xì)胞內(nèi)，可將冰凍保護(hù)劑分為兩類：一是滲透性冰凍保護(hù)劑，包括二甲基亞砜、甘油、乙二 醇、 丙二醇、乙酰胺等，此類冰凍保護(hù)劑多數(shù)為低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子發(fā)生水合作用， 使溶液的粘性增加，弱化了水的結(jié)晶過(guò)程，從而起到了保護(hù)效果;二是非滲透性冰凍保護(hù)劑，包括蔗糖、葡萄糖、聚乙二醇等，這類物質(zhì)能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，它能使溶液呈過(guò)冷狀態(tài)，從而起到保護(hù)作用。

發(fā)現(xiàn)海藻糖能與磷脂相互作用而穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，防止冰凍對(duì)細(xì)胞膜造成直接損傷， 因而它也被用作冰凍保護(hù)劑。Bhandal等用海藻糖作唯一的冰凍保護(hù)劑， 成功地保存了胡蘿卜、煙草等細(xì)胞培養(yǎng)物。另外，脯氨酸也可作為冰凍保護(hù)劑起到穩(wěn)定凍存細(xì)胞中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的效果。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用一種冰凍保護(hù)劑，其保存效果并不理想，近幾年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多研究都在嘗試采用復(fù)合冰凍保護(hù)劑。復(fù)合冰凍保護(hù)劑的 優(yōu)越性在于它能充分發(fā)揮各種成分的保護(hù)作用， 從而產(chǎn)生累加效應(yīng)。10%或5%二甲基亞砜(DMSO)配合一定濃度的甘油或糖，能顯著提高超低溫保存后的成活率，而其中糖的種類也因保存材料不同而異。

作為冰凍保護(hù)劑應(yīng)具備以下3個(gè)特性：易溶 于水;在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)是無(wú)毒的;化凍后易從保存材料中清除。另外， 冰凍保護(hù)劑處理應(yīng)在低溫下進(jìn)行，而且處理時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般為20～120min。如桑芽用0.5mol/L山梨糖醇液浸漬過(guò)夜，再用10%DMSO與0.5mol/L山梨糖醇液浸漬處理20min，能顯著提高超低溫保存后的 成活率。

3.2 再生植株的遺傳性狀和表型特征的變化

對(duì)超低溫保存木瓜的基因 型和表觀遺傳變化的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)超低溫處理 的再生植株， DNA的甲基化修飾最高達(dá)6.62%，并檢測(cè)到了相應(yīng)目的條帶。

對(duì)超低溫保存的金絲桃再生植株的遺傳和生化特征進(jìn)行分析研究，結(jié)果表明處理植株的再生率和染色體數(shù)目均具有穩(wěn)定性，僅在非編碼序列存在微量的突變。

有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)低溫處理的人參在產(chǎn)量方 面未發(fā)生變化;超低溫保存的紫錦蘇組培植株，同對(duì)照具有相同的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)品特性。

3.3 超低溫保存中超微結(jié)構(gòu)的變化

研究表明：預(yù)培養(yǎng)降低了細(xì) 胞的液泡化程度，線粒體嵴變得更為發(fā)達(dá)，同時(shí)細(xì)胞的代謝活性增加，而未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞凍后很 難存活。保護(hù)劑處理為超低溫保存的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但保護(hù)劑處理可造成細(xì)胞損傷，從超微結(jié)構(gòu)上 看引起核周隙擴(kuò)張、膜囊泡化及細(xì)胞骨架的塌陷。

在對(duì)香蕉莖尖進(jìn)行超低溫保存的過(guò)程中，Heliot等(2003)對(duì)保存材料在各個(gè)步驟的超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了連續(xù)觀察， 結(jié)果表明無(wú)論在冷凍/解凍步驟還是冷凍保護(hù)劑處理期間，大部分分生組織細(xì)胞都受到損傷，僅位于分生組織圓頂周邊極小范圍內(nèi)的細(xì)胞存活下來(lái)。

4、展望

種質(zhì)資源是產(chǎn)業(yè)安全和可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略資 源，世界各國(guó)十分重視種質(zhì)資源的收集和創(chuàng)新利 用。目前我國(guó)果樹種質(zhì)資源保存的主要手段是圃地保存和組培保存，圃地保存占地大、管理費(fèi)時(shí)費(fèi)工，并且受到氣候條件、病蟲害等威脅;組培保存存在著易感染、費(fèi)工費(fèi)電、雜合個(gè)體性狀容易退化、生活力下降等缺點(diǎn)。

超低溫冷凍離體保存能夠彌補(bǔ)以上不足，該方法建立在生物細(xì)胞凍害和抗凍機(jī)理的基礎(chǔ)上。種質(zhì)超低溫保存成功的關(guān)鍵在于降溫冰凍過(guò)程中避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰，為此，針對(duì)不同種類的植物材料，篩選適合的冰凍保護(hù)劑，采用適當(dāng)?shù)慕禍乇鶅鏊俣群突瘍龇绞?，可使?xì)胞不受損傷或使損傷減 小到最低程度。目前的研究表明， 影響植物材料超低溫保存效果的因素很多，不同的植物或同一 植物的不同材料類型，其保存的難易和效果均不同。因此，要根據(jù)材料本身的特性，對(duì)影響保存的因素進(jìn)行研究，尋找提高超低溫保存成活率和再生率的有效途徑和方法，從而達(dá)到成功保存種質(zhì)資源的目的。

目前，超低溫保存技術(shù)的研究大多停留在方法上，供試種質(zhì)材料的保存時(shí)間短，少有長(zhǎng)期保存再生情況的報(bào)道，對(duì)離體種質(zhì)保存過(guò)程中遺傳穩(wěn)定性的研究也很少，研究對(duì)象范圍狹窄，而且對(duì)同一物種不同品種的研究結(jié)果也不盡一致。因此，今后的研究方向一是重點(diǎn)選擇需優(yōu)先保護(hù)的瀕危 物種， 用已成熟的技術(shù)進(jìn)行較大規(guī)模的中長(zhǎng)期保存及遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，探討超低溫保存的實(shí)際應(yīng)用效果;二是對(duì)已經(jīng)建立完善再生體系且在生產(chǎn)上具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的果樹， 例如櫻桃、核桃、板栗、梨、棗、藍(lán)莓等，探索安全簡(jiǎn)便、長(zhǎng)期穩(wěn)定的超低溫保存技術(shù)體系。MVE液氮罐